Injections de matrices d’ADN à l’aide de pointes à l’échelle nanométrique :

Aperçu:

L’équipe de recherche de l’Université de technologie de Toyohashi dirigée par le Prof. Rika Numano et Pr. Takeshi Kawano a montré que des injections de tampons d’ADN peuvent être effectuées en délivrant des biomolécules dans des cellules neuronales vivantes dans les tissus cérébraux ex vivo: et: invivo : utilisant des réseaux de fils à pointe nanométrique (NTW) pour modifier génétiquement et restaurer la fonction cellulaire dans le cerveau.

Ces injections de réseau NTW ont suivi l’exploration de cellules de stimulateur cardiaque dans la tranche cérébrale de l’horloge centrale avec fonction de knockdown en utilisant l’injection d’ARN en épingle à cheveux courte d’un gène d’horloge indispensable dans les rythmes circadiens.

Des détails:

Les matrices NTW avec des diamètres <100 nm et des longueurs de fil d'environ 200 arem sont fabriquées grâce à la croissance de matrices de microfils de silicium et à la formation de nanopointes, fabriquées à l'origine à l'Institut de recherche interdisciplinaire d'inspiration électronique (EIIRIS) de l'Université de technologie de Toyohashi. Ils montrent que l'ADN peut être délivré de manière peu invasive et exprimé dans plusieurs cellules d'une tranche de cerveau : ex vivo: et dans un cerveau de souris vivant : invivo : en appuyant simplement sur le tableau NTW pour la recombinaison génétique comme en appuyant sur un tampon sur une surface de tissu cérébral (Fig.1).

Cette technique utilise des injections d’ADN multicellulaires ponctuelles dans des zones profondes du tissu cérébral à l’aise, permettant aux cellules cibles d’être marquées par des vecteurs d’expression de protéines fluorescentes (Fig.2). De plus, l’injection de biomolécules à base de nanofils indique qu’il s’agit d’un outil pratique et puissant pour modifier génétiquement la fonction des cellules cérébrales vivantes, y compris l’injection d’ARN en épingle à cheveux court (shARN) pour les fonctions de knockdown et d’ARNg et d’ADN vecteur CAS9 pour le génome. édition.

Dans cette étude, des injections de tampons ADN de shARN de : Bmal1 :un gène d’horloge critique dans les rythmes circadiens des mammifères avec une période d’environ 24 heures, réprime la fonction des cellules du stimulateur cardiaque dans la tranche de cerveau du noyau suprachiasmatique (SCN) de Par1 :::luc : souris transgéniques (Tg) (Fig.3).

Cette technique a un potentiel non seulement pour la transfection biologique dans les cellules neuronales, mais aussi pour les enregistrements électrophysiologiques. Notre technique d’injection de réseau NTW permet aux gènes de marquer et de modifier fonctionnellement les cellules vivantes dans les zones profondes du tissu cérébral lors de l’enregistrement intracellulaire. Il est utile pour surmonter le goulot d’étranglement dans l’étude neurophysiologique.

Contexte de développement :

L’Institut de recherche interdisciplinaire inspiré de l’électronique (EIIRIS) de l’Université de technologie de Toyohashi possède l’usine LSI pour la conception, le traitement et l’évaluation des LSI, des capteurs et des MEMS. Il est équipé d’une installation d’expérimentation des sciences de la vie qui mène des expériences animales et biologiques. Par conséquent, chez EIIRIS, l’appareil développé est appliqué dans des expériences physiologiques, et les résultats sont immédiatement restitués pour l’amélioration de l’appareil, et des équipes de recherche de différents domaines scientifiques collaborent au développement technologique et à la recherche. La disposition de plusieurs fils chargés sur la puce peut être librement modifiée pour le timbre génétique à l’aide d’un dispositif de réseau NTW, de sorte qu’il peut être mis à jour vers un plus approprié grâce à des commentaires en fonction du site cible.

Perspectives d’avenir :

Le potentiel intracellulaire peut également être mesuré avec le tableau NTW après l’interconnexion de l’appareil, donc enfin, ils peuvent identifier les cellules qui sont mesurées par le tableau NTW avec un signal fluorescent après l’insertion de l’ADN marqueur fluorescent dans les cellules pendant la mesure électrophysiologique. De plus, étant donné que cette technologie d’estampage génétique peut être utilisée pour le knockdown tel que l’ARNi et pour le knockout, l’édition du génome et la manipulation génétique, il est possible de manipuler génétiquement une partie spécifique du cerveau. L’équipe de recherche espère contribuer à utiliser la technologie d’estampage génétique pour de nouvelles recherches afin d’élucider les fonctions cérébrales dans le domaine des neurosciences.

Organisme de financement:

Cette étude a été soutenue par des subventions de recherche de la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), le Global COE Program, le Program to Foster Young Researchers in Cutting-Edge Interdisciplinary Research (to RN), Grants-in-Aid for Scientific Research ((S, A) à MI, (B, A) à TK, (C) à RN et (B) à TI) et pour les jeunes scientifiques (A) (à TK) de JSPS, le programme PRESTO (à TK ) de la Japan Science and Technology Agency (JST), la Takeda Science Foundation (à RN), la Asahi Glass Foundation (à RN), Research Grant for Science & Technology Innovation at the Toyohashi University of Technology (à RN et TK), et le programme d’avancement stratégique des robots ultra-humains polyvalents et des technologies d’intelligence artificielle de NEDO. R. Goryu était boursier JSPS. Y. Kubota a été partiellement soutenu par le Leading Graduate School Program R03 du MEXT.

Référence:

Rika Numano, Akihiro Goryu, Yoshihiro Kubota, Hirohito Sawahata, Shota Yamagiwa, Minako Matsuo, Tadahiro Iimura, Hajime Tei, Makoto Ishida et Takeshi Kawano. Les injections de réseaux de fils à pointe nanométrique transfèrent l’ADN directement dans les cellules cérébrales : ex vivo: et: invivo, FEBS Open Bio, 2022 : dans la presse, doi : 10.1002 / 2211-5463.13377.

Glossaire:

ARNg (ARN guide) : Un court brin d’ARN avec une séquence d’échafaudage nécessaire pour lier la protéine CAS9 afin de déterminer le site de clivage de CAS9 pour l’édition du génome par les systèmes CRISPR-CAS9.

shRNA (ARN en épingle à cheveux court): Un court brin d’ARN avec une structure en épingle à cheveux pour faire taire l’expression du gène cible par l’ARNi (interférence ARN).

Par1 :::luc : souris transgénique : Une souris dans laquelle : Par1 :::luc : Le gène recombinant est inséré dans le génome de toutes les cellules pour surveiller les rythmes circadiens à l’aide de la bioluminescence. Par1 : est l’un des gènes de l’horloge à expression rythmique avec une période de 24 heures. Par1 :::luc : est un gène recombinant dans lequel : Par1 : La région promotrice est suivie par l’enzyme luciférase dérivée de la luciole en tant que rapporteur.

scRNA (ARN brouillé): Un court brin d’ARN avec une séquence de bases aléatoire a été utilisé comme contrôle négatif du shRNA fonctionnel.